前言

基于RNA的疗法在基因水平的疾病干预方面显示出巨大的前景，其中一些疗法已被批准用于临床，包括最近的COVID-19信使RNA疫苗。RNA疗法的临床成功很大程度上取决于使用化学修饰、配体缀合或非病毒纳米粒子来提高RNA稳定性并促进细胞内递送。与分子级或纳米级方法不同，宏观水凝胶是柔软的、水溶胀的三维结构，具有生物可降解性、可调节的理化性质和可注射性等显着特征，最近它们在RNA治疗中的应用引起了极大的关注。具体来说，水凝胶可以被设计为对RNA治疗剂的释放进行精确的时空控制，从而有可能最大限度地减少全身毒性并增强体内疗效。本综述全面概述了RNA的水凝胶负载和控释水凝胶设计，重点介绍了它们的生物医学应用，并提供了我们对RNA递送这一令人兴奋的领域的机遇和挑战的看法。

摘要

基于核酸的疗法，例如DNA、反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)和信使RNA(mRNA)，已广泛用于各种生物医学应用。作为所有已知生命所必需的一类核酸，RNA分子发挥着多种调节作用，例如指导蛋白质表达和调节靶基因。到目前为止，几种RNA疗法（主要是siRNA和mRNA）已被临床批准用于不同的疾病（表1），还有许多其他疗法正在进行临床试验。mRNA帮助身体制造自身缺失的、有缺陷的或有功能的外源蛋白质（例如抗原），而siRNA则减少内源表达蛋白质或病理蛋白质的表达。此外，microRNA(miRNA)和其他非编码RNA也被探索用于在转录后水平调节基因表达。

表1批准用于临床的RNA疗法

尽管RNA具有相当大的治疗潜力，但据报道其体内递送存在局限性，包括酶敏感性、细胞外和细胞屏障以及运输至亚细胞区室的困难，亚细胞区室中的货物将具有活性。因此，大多数临床阶段的RNA疗法基于化学修饰（例如硫代磷酸酯键）、配体缀合（例如N-乙酰半乳糖胺（GalNAC））或非病毒纳米颗粒（NP）递送（例如脂质NP)具体来说，化学修饰提高了酶和代谢稳定性，配体缀合提高了向特定器官和细胞类型的递送。最后，NP可以保护封装的RNA并改善药代动力学和内体逃逸。然而，这些递送方法有其自身的局限性，需要进一步改进转染效率、器官/细胞递送特异性、RNA稳定性和规避免疫激活，这可能需要开发完全不同类别的递送系统。沿着这些思路，最近人们做出了大量努力来探索使用大尺度水凝胶进行基于RNA的治疗递送，以及从基因沉默和蛋白质替代到免疫调节的各种生物医学应用（图1）。

图1：最近基于水凝胶的RNA递送的临床前研究的时间表。

水凝胶由水溶胀的三维网络组成，概括了天然细胞外基质(ECM)的固有特性，使其可用于组织工程、药物输送、细胞形态发生等。水凝胶独特的理化特性可以维持RNA的生物活性，作为局部递送载体（例如可注射系统）保留和持续释放RNA，以及按需将高浓度的有效负载递送到目标位点/通过刺激响应策略的脉冲方式（图2）。因此，水凝胶可以提高RNA稳定性，减少与全身递送相关的不必要的治疗损失，减轻不良的脱靶毒性并避免多次剂量的必要性。所有这些使水凝胶成为基于RNA的治疗递送的有吸引力的系统，与上述临床阶段平台相补充。

图2：水凝胶作为RNA递送平台的优势。

水凝胶中的RNA负载

      可以通过直接包含裸露RNA或通过封装RNA纳米载体将RNA加载到水凝胶中（图3）。裸露RNA的加载很大程度上取决于RNA和水凝胶网络之间的物理化学相互作用。相比之下，纳米载体可以提供改进的RNA生物活性、更好的RNA释放可控性和特定细胞的靶向性，而负载量取决于纳米载体与水凝胶的相互作用。

图3：用于RNA装载和递送的功能性水凝胶。
a，RNA无需任何操作（裸RNA）或通过纳米载体加载到水凝胶中。
b，装载RNA的水凝胶可用作可植入支架或作为局部RNA递送的可注射凝胶。
水凝胶的物理、生化和生物学特性可微调，可实现RNA的持续和/或可控释放。
进入细胞后（例如，通过裸露RNA或装载RNA的纳米载体），
RNA到达适当的亚细胞区室以启动蛋白质产生/抑制。

裸露的RNA

人们已经开发出多种策略将裸RNA加载到水凝胶中，例如静电相互作用、共价缀合、主客体相互作用或其组合（图4）。在这里，我们介绍了每种策略和相关的水凝胶，并讨论了它们递送裸RNA的特性。

图4：将裸露RNA加载到水凝胶网络中的策略。

离子键

阳离子/可电离聚合物和脂质是研究最广泛的非病毒递送材料，可以与带负电的生物分子相互作用，使离子键成为将RNA和其他核酸封装在水凝胶中的简单而可靠的方法。然而，合成聚阳离子可能会导致中度至高度毒性，这主要是由于其高正电荷。此外，合成阳离子聚合物通常具有低分子量和高度支化结构，这可能限制它们在水凝胶形成中的潜在应用。因此，合成和天然聚阳离子与水凝胶的缀合或使用仅基于天然聚阳离子的水凝胶的出现来解决这些问题。例如，研究了几种不同的可生物降解聚合物和制造系统，用于局部递送裸siRNA：钙交联藻酸盐、光交联藻酸盐和酸溶胶原。siRNA在一周内从带高负电荷的藻酸盐水凝胶中快速释放，但由于胺基团的影响，需要两周以上才能从胶原水凝胶中释放。带正电荷的聚乙烯亚胺(PEI)或壳聚糖的掺入进一步延迟了siRNA的释放。此外，离子键容易受到pH变化的影响，这可能会阻碍负载生物分子的持续释放。每个聚合物的电荷基团（例如伯、仲、季氨基和脒基团）的数量和类型等因素也可以帮助确定最终的释放曲线。

氢键

带中性电荷的聚合物如聚乙烯醇（PVA）可以通过正氢原子的相互作用与核酸结合，这与带负电的受体原子建立静电连接。这种聚合物可以用某些化学部分进一步修饰，以增加水凝胶和RNA之间的分子间氢键相互作用。同样，带负电荷的多糖如藻酸盐和透明质酸(HA)已被探索用于促进RNA的受控释放，RNA也可以用其他部分进行修饰，以增加与封装核酸的氢键数量。例如，HA-PVA水凝胶在体外释放siRNA的速度比PVA水凝胶慢，这归因于siRNA和HA主链之间的氢键数量较多。需要强调的是，氢键主要是弱静电相互作用，可能不会诱导RNA与水凝胶的强烈结合。因此，有时通过向水凝胶配方中添加阳离子分子或聚合物，氢键和离子键结合起来以增强水凝胶和RNA之间的相互作用。

共价键

RNA与水凝胶主链的共价缀合允许大量RNA的均匀且可预测的分布，同时具有最小的初始爆发释放。尽管这种方法在小分子药物递送中非常常见，但共价结合RNA的例子却很少。例如，siRNA通过迈克尔加成化学共价连接到光交联葡聚糖水凝胶上。酯和/或二硫键水解降解后，与前12小时内释放的未结合化合物相比，siRNA的释放曲线延长至10天。通过调整水凝胶网络中的可降解连接或束缚siRNA的量，可以控制货物量及其分布释放。然而，将siRNA结合到水凝胶网络中具有额外的技术复杂性。

疏水相互作用

疏水相互作用通过形成笼形笼而发生，笼形笼是疏水体52周围通过氢键形成的冰状水分子基质。主客体对相对容易合成，并且可以与生物分子相互作用，通常由分子大小和疏水性驱动。客体-主体对广泛用于可注射水凝胶的制造，主要是因为它们的动态键可以重组44。例如，环糊精(CD)显示出相对较低的毒性和较高的水溶性，使一系列疏水性客体分子能够嵌入其内部空腔。HA用CD（作为主体）或金刚烷（作为客体）进行修饰，然后自组装成可注射水凝胶。HA组装系统能够形成复杂的CD-胆固醇修饰的miR-302相互作用，从而实现miRNA的局部和持续释放。在三周内测量了HA水凝胶网络中miRNA的释放（体外研究），其速度比水凝胶的侵蚀速度更快。因此，假设miRNA从水凝胶网络中扩散，突出了HA对miRNA的阴离子排斥以及水凝胶客体相互作用的关键作用。

作为一种替代方法，超分子水凝胶也可以通过生物相容性小分子水凝胶剂的自组装形成，这是由水凝胶剂分子和RNA的分子内π-π堆积触发的。例如，用脲基嘧啶酮部分（UPy-PEG）修饰的聚乙二醇（PEG）能够在水中二聚，产生纤维状超分子水凝胶。siRNA和miRNA与胆固醇共价结合，直接与纤维的疏水核心相互作用，从而微调siRNA和miRNA的释放。另外，可以添加超分子水凝胶剂分子（例如，四唑和螺吡喃）以促进与封装的RNA结构内氨基酸的疏水侧链的疏水相互作用。然而，在这些水凝胶中，疏水部分与亲水区域的比例必须仔细调整以保持吸水能力。还应该指出的是，这种疏水相互作用并不取决于RNA本身，而是取决于RNA上的疏水修饰剂。

非特异性相互作用

在某些情况下，水凝胶中的RNA负载仅由非特异性相互作用介导。因此，RNA释放可以简单地通过扩散控制机制来控制，这将在下一节中详细讨论。例如，可以增加交联密度，从而降低溶胀和药物释放速率，或者通过改变大分子结构来减小大分子网格尺寸，从而延长药物释放时间。这通常是热敏水凝胶的情况，例如聚(N-异丙基丙烯酰胺)，其可以在体内施用时由溶胶到凝胶相变引发而形成。热水凝胶的一个主要限制是它们缺乏生物降解性，这可以通过将它们与可生物降解的聚合物共聚来解决。通过掺入阳离子聚合物可以进一步克服对RNA释放曲线的有限控制。

RNA纳米载体

与裸RNA策略相比，在水凝胶网络中加载RNA纳米载体（例如脂质体/脂质纳米颗粒、聚合纳米颗粒和无机纳米材料）的递送可以避免RNA和水凝胶聚合物的化学修饰，并提高负载、稳定性和转染效率。（图3)下面，我们概述了水凝胶中几种代表性RNA纳米载体的负载。

脂质纳米载体

阳离子/可电离脂质可以脂质体或RNA/脂质复合物的形式使用，例如脂质复合物和类脂质体。纤维蛋白凝胶能够支持细胞迁移，同时保持慢病毒活性。基于纤维蛋白的水凝胶表面与负载siRNA的lipofectamine结合，以增加其细胞内化水平并敲低拮抗剂（例如头蛋白）。3天后，约20%的游离siRNA或与lipofectamine复合的siRNA保留在纤维蛋白表面上，因此表明纤维蛋白的负电荷似乎不会影响纳米复合物的表面保留。另一方面，与仅全身施用mRNA-lipoplex相比，使用含有mRNA-lipoplex的可注射壳聚糖-海藻酸盐支架证明能够诱导体内局部转染并增加抗体产生和T细胞增殖水平60。值得注意的是，使用RNA脂质体负载水凝胶的已发表研究数量仍然有限，这可能是由于脂质体的热力学不稳定性及其在带电水凝胶中的进一步聚集来解释。

聚合物纳米载体

阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺(PEI)壳聚糖和聚(1-赖氨酸)(PLL)通常用于产生聚合复合物。与基于脂质的纳米载体不同，阳离子聚合物由于通常不存在疏水部分46而完全溶于水。此外，阳离子聚合物能够将核酸压缩至比阳离子脂质更小的尺寸。RNA-聚合物纳米载体的一个潜在缺点是，对于一些柔软且带电的纳米粒子，在加载过程中可能会发生聚集，这可能会限制可以加载到水凝胶中的RNA量。基于胶原蛋白的水凝胶与天然ECM非常相似，已被用于RNA纳米复合物的局部递送。一种特定的胶原水凝胶能够在体外持续递送siRNA/PEI纳米复合物超过10天32。然而，胶原水凝胶中的外来蛋白质可能会引起异物反应，这可能会阻碍其生物应用。沿着这些思路，基于HA的水凝胶可能是RNA递送的首选之一。将环加氧酶改造的miRNA（COX-1和COX-2）质粒加载到PLGA/PEINP复合物上，然后嵌入HA水凝胶中。与质粒/纳米粒子复合物相比，检测到水凝胶的释放更慢、更持续。聚合物纳米载体与水凝胶可能的相互作用可能会影响释放速率。事实上，已经报道了水凝胶内负载RNA的NP的聚集和失活。为了解决这个问题，用琼脂糖涂覆NP、将NP共价连接到水凝胶主链或类似的策略可以应用于设计此类递送系统。

无机纳米载体

无机胶体纳米颗粒（例如金、氧化铁、二氧化硅和量子点）已被用于RNA治疗，主要是因为其合成过程简便且可用性广泛。例如，基于PEI的水凝胶与siRNA-Au-Fe3O4纳米胶囊缀合。与静脉注射纳米胶囊相比，皮下注射纳米胶囊水凝胶具有更好的肿瘤渗透性和更长的血液循环时间。当然，AuNPs允许通过金-硫醇共轭进行多种功能化，广泛用于多模式方法。含有阿霉素和siRNA的多功能量子点DNA水凝胶比单独的siRNA更能显着减少EGFR的表达。量子点DNA水凝胶能够作为递送载体，无需有毒转染剂，并已证明对乳腺癌具有较高的体内治疗功效。无机核-水凝胶支架与胶体纳米粒子的结合引入了具有不同核尺寸、电荷、涂层和水凝胶物理拉伸/压缩的新支架结构的可能性。

用于受控RNA释放的水凝胶设计

RNA从工程水凝胶网络中的释放曲线，包括RNA可用性的持续时间（短期与长期）和释放模式（连续与脉冲），将在很大程度上取决于目标应用。因此，多种水凝胶设计被用来通过被动或主动机制促进RNA的受控释放。虽然被动机制可以实现连续的短期和长期释放，但主动机制可以产生脉动释放模式。在下一节中，将全面回顾这些从水凝胶中受控释放裸RNA或RNA纳米载体的机制（图5）。

图5：受控RNA递送的水凝胶功能特性。
a，封装的裸RNA和/或RNA纳米载体的最终释放曲线由水凝胶的物理特征和RNA-水凝胶相互作用决定。
b，局部给药后，外部或内部刺激可以触发封装的RNA的释放。
c，封装的裸露RNA和/或RNA纳米载体的说明性释放曲线。
d，以裸露形式或与水凝胶系统组合施用的RNA治疗剂的说明性生物分布概况。
e，裸露形式或与水凝胶系统组合的有效负载在植入部位的说明性局部积累曲线。

用于连续释放RNA的水凝胶

水凝胶的连续被动释放是通过单独的作用或扩散、水凝胶网络降解和水凝胶膨胀等因素的组合来实现的。因此，除了上述用于与RNA相互作用的水凝胶化学性质之外，还可以通过设计水凝胶特征来调节被动释放，例如分子量、基质浓度、交联密度、亲水性和孔径分布。

可水解降解的官能团，例如酯基团，已被纳入水凝胶主链中作为控制释放速率的手段。为此，基于硫醇-烯相互作用，使用八臂硫醇修饰的PEG(8-arm-PEG-SH)与八臂丙烯酸修饰的PEG(8-臂-PEG-A)，其在每个臂上含有一个酯基团；或八臂单(2-丙烯酰氧基乙基)琥珀酸酯修饰的PEG(8-臂-PEG-MAES)，其在每个臂上含有三个可水解酯基团。与其他两种相比，大分子网络中具有较高酯键的水凝胶（8臂-PEG-MAES）表现出更快的膨胀和降解，这导致RNA-PEI纳米复合物更快的释放（19天内85.09±2.43％）水凝胶制剂。

通过调整纳米载体的尺寸和浓度可以进一步调节释放速率。光交联的DEX水凝胶(DEX-HEMA)通过可生物降解的酯键与阳离子线性PEI甲基丙烯酸酯(LPEI-GMA)共价官能化。siRNA与阳离子线性PEI发生静电相互作用。因此，通过生物可降解酯键的DEX-HEMA水凝胶的降解率和siRNA/PEI相互作用的程度来微调siRNA的释放，这是通过控制水凝胶（8和12wt%）和/或纳米载体来实现的（0、5和10μg）浓度。水凝胶能够长时间（9至17天）释放siRNA。值得注意的是，观察到的RNA在很长一段时间（几周）内从水凝胶网络中持续释放可能不利于诱导显着的生理反应。事实上，从水凝胶网络释放的少量RNA不足以促进全身给药（或几次局部给药）可以实现的目标效果。

用于刺激响应性RNA释放的水凝胶

为了解决与被动释放相关的问题，使用主动释放机制实现了水凝胶中RNA的按需递送。主动释放是响应内部（例如pH和酶）或外部刺激（例如光辐射）而实现的，这可以促进水凝胶网络的按需降解，从而促进RNA释放。通过外部刺激触发RNA释放，引入了对特定剂量和特定时期内RNA递送的额外控制，为医生或患者递送策略提供了替代方案。

pH响应释放

pH响应性水凝胶通常含有希夫碱键，该键在pH7.4下稳定，但在酸性环境（例如pH6.8）中被破坏75。这种水凝胶适合在与酸性组织微环境相关的疾病（例如癌症和心肌梗塞（MI））中按需释放RNA。例如，基于负载miRNA的胺功能化介孔二氧化硅NP(MSN)、醛功能化PEG(PEGCHO)和α-CD76的组合创建了pH敏感水凝胶。水凝胶的制造依赖于希夫和PEGCHO、α-CD和MSN之间的疏水相互作用。在微酸性环境（pH6.8）下，希夫碱键断裂产生醛官能团，MSN/miR-21-5p从水凝胶中释放（体外1周75%）至梗塞区域。而在pH7.4时，只有6%的MSN/siRNA纳米复合物从水凝胶中释放出来。有趣的是，pH刺激时释放的RNA量对于MI治疗是有效的。

酶响应释放

酶敏感水凝胶通常含有与酶敏感肽接头交联的聚合物网络。在某种酶（例如基质金属肽酶2(MMP-2)、蛋白酶、胰蛋白酶和溶菌酶）存在下，肽接头被破坏，从而导致捕获的RNA治疗剂从水凝胶中释放出来。沿着这些思路，通过氢腙键（即醛修饰的HA和酰肼修饰的HA）和蛋白酶可降解的肽交联剂形成基于HA的水凝胶。然后，将CD修饰的HA引入水凝胶系统中，以隔离胆固醇修饰的siRNA，如前所述。正如预期的那样，水凝胶被侵蚀，靶向MMP2的siRNA被释放，以响应MI治疗的蛋白酶（例如胶原酶）水平。在另一项研究中，MMP-2可降解水凝胶负载了肿瘤生长因子-β1siRNA复合物，并进一步吸附到电纺纤维上。由于水凝胶中MMP-2底物肽的降解，高MMP-2浓度促进了聚合复合物的更快释放，而添加MMP-2对siRNA从含有MMP-2不可降解交联剂的水凝胶中释放几乎没有影响。

光触发释放

光响应水凝胶提供按需空间和时间控制。一般来说，这些水凝胶含有单个或多个光可裂解部分（例如，具有酯或酰胺键的硝基苄基连接体），具有响应光波长和强度以及辐射时间的可变降解特性。虽然裸露的RNA通过光不稳定键连接到水凝胶网络上，但RNA纳米载体被封装在通过这些光敏键交联的水凝胶中。可光降解的PEG-二（光不稳定丙烯酸酯）（PEG-DPA）一直被用作这些水凝胶的构建块。暴露在紫外线(UV)光下时，与邻硝基苄基光不稳定基团连接的酯基会裂解成缩醛和酸性部分，从而促进siRNA释放。还使用Michael加成法制备了不稳定性水凝胶，以控制siRNA-PEI纳米复合物的释放。具有最低量的光不稳定部分的光降解水凝胶显示出酯键水解降解率的增加，从而增强了siRNA治疗剂的释放。此外，对光不稳定的水凝胶释放的siRNA谱也受到紫外线照射的影响。值得注意的是，通过使用基于PEG的水凝胶，通过无铜点击反应并与UV可裂解的Chol-miR-26a缀合，实现了miRNA的选择性递送，从而可以通过定制UV照射时间和UV强度来控制miRNA的释放。

总而言之，具有可光降解连接体的水凝胶的正确设计可以在紫外线辐射下实现RNA治疗剂的按需释放。然而，由于紫外线的穿透性较低，这些水凝胶可能不适合在深层组织中使用。

生物医学应用

RNA疗法的水凝胶递送已应用于多种生物医学应用（表2）。水凝胶主要用于促进RNA治疗药物在疾病部位的局部给药，并保护RNA免受先天免疫反应的影响。然而，根据疾病病理学，可以对水凝胶进行修饰以产生不同的释放曲线，以最大限度地发挥RNA疗法的功效。下面，我们主要重点介绍RNA递送水凝胶在癌症治疗、骨再生、心脏修复和伤口愈合中的应用（图6）。

表2基于水凝胶的RNA递送的生物医学应用

图6：基于水凝胶的RNA递送的生物医学应用。

癌症治疗

全身性癌症治疗对于转移是有用的，但也与全身毒性和由于主要器官中的渗漏/积聚而可能产生的免疫原性有关。在这种情况下，水凝胶可以促进RNA治疗剂的长期持续局部递送，以减少潜在的副作用，同时攻击原发性肿瘤，重新编程原发性肿瘤以防止转移81和/或抑制原发性肿瘤复发后手术切除。因此，通过RNAi技术可以有效抑制不同类型的活化癌基因mRNA或miRNA，从而抑制肿瘤的生长。例如，含有RNA治疗剂（例如，miRNA）的NP可以嵌入水凝胶基质中，水凝胶基质又被植入到肿瘤旁边。值得注意的是，由双组分系统组成的水凝胶网络，即氧化多糖和含胺树枝状聚合物之间的席夫碱相互作用，证明了使用醛与胺基团的比例来控制RNA治疗剂的释放速率。然而，高度交联的水凝胶会阻碍嵌入的RNA治疗剂的释放，从而降低治疗效果。为了解决这一问题，使用单组分可注射复合水凝胶来以更高的效率递送RNA治疗剂（例如siRNA）。通常，这些复合物系统含有热敏部分，在注射到目标组织后允许溶胶到凝胶的转变。随后，含有RNA的聚合复合物从这些凝胶中的释放速率取决于它们的溶解速率，这可以通过掺入对水解或酶活性敏感的可降解接头来进一步控制。因此，用于癌症治疗的水凝胶介导的RNA疗法的递送需要纳米载体在肿瘤周围的长期保留，这增强了特定癌细胞群的摄取。这在治疗脑肿瘤时变得至关重要，因为此类平台能够克服生物屏障（主要是血脑屏障），向脑组织提供治疗药物。一般来说，用于在癌症中递送RNA治疗剂的水凝胶已被证明具有增强的生物利用度和增加的肿瘤积累，同时减少在非靶组织中的归巢。在癌症方面，RNA水凝胶递送不仅限于致癌基因的沉默，即将到来的下一个伟大成就可能是操纵免疫调节因子来招募免疫细胞进行癌症免疫治疗。

骨再生

骨再生和修复是水凝胶介导的RNA递送显示出前景的另一个领域。骨愈合依赖于多种动态和时空机制，包括关键细胞（即炎症细胞、血管细胞、骨软骨祖细胞和破骨细胞）和分子水平（即促炎细胞因子、生长因子）的炎症、修复和重塑阶段。因子，以及血管生成和促骨生成因子）。因此，水凝胶调节RNA治疗剂的时空和剂量控制释放以满足骨再生过程中高度复杂的微环境至关重要。相应地，如果将水凝胶用作支架，它们的降解应与向内生长的组织的速率相关，以提供足够的机械支撑。鉴于这些要求，可光降解水凝胶已显示出促进RNA治疗剂按需释放的巨大潜力。在这些系统中，水凝胶含有可水解降解的键（例如二硫键和/或酯键）以及可光解降解的位点（硫醇-丙烯酸酯键）。因此，紫外线辐射会引起水凝胶网络中不稳定性连接的光降解，影响水凝胶的理化性质，例如膨胀和降解速率。结果表明，紫外线辐射可以导致siRNA从这些水凝胶中更快释放，并且可以通过调整水凝胶组合物中光不稳定基团的比例来进一步改变相关的释放速率。这种水凝胶允许直接在患病部位暂时调节RNAi的表达，已知这可以增强骨形成。尽管研究已经探索了成骨诱导治疗剂的递送，但也可以研究其他细胞反应，包括血管生成和细胞浸润。

心脏修复

心肌梗死是由冠状动脉闭塞引起的，导致局部缺血、组织损伤，最终导致心力衰竭。有一些有趣的方法已应用于增强ECM稳态和血管生成或预防纤维化和钙失衡，即siRNA、miRNA和短发夹RNA(shRNA)的传递。值得注意的是，使用自愈水凝胶通过微创方法（例如导管）注射到梗塞部位，并且能够在剪切停止后重新形成，这是应对RNAi治疗递送和保留挑战的一个有前途的选择。为此，已经采用多种化学方法，包括离子键和动态共价键（腙键和客体-主体相互作用）来产生用于RNAi递送的可注射自愈水凝胶。其中，客体水凝胶（涉及CD分子）可以通过疏水相互作用促进胆固醇修饰RNAi的缓慢释放。刺激响应连接（例如，蛋白酶敏感的和pH响应的）也被用作其他手段来实现可注射自愈水凝胶的按需释放。特别是，选择这两种刺激是因为MI与组织微环境的变化有关，包括pH值降低（从7.4至6.8）和蛋白水解活性的局部上调。这强调了在设计用于RNA递送的水凝胶时考虑疾病病理学的重要性。一般来说，使用可注射自愈水凝胶进行RNAi递送的一个显着优点是，单剂量施用此类系统可以在较长时间内（一到三个月）显着且持续地恢复梗塞心肌并增强心脏功能。鉴于免疫反应在MI疾病进展和修复中的作用，水凝胶可以在提供RNA治疗剂以操纵巨噬细胞和调节性T细胞、限制促炎反应和增加梗死区域的再生细胞因子方面发挥重要作用。

伤口愈合

伤口愈合是一个精心策划和调节的过程，可以分为三个重叠的阶段：止血和炎症、增殖和组织重塑。然而，该过程因病理生理条件而严重失调。RNAi疗法已经显示出解决所有三个阶段的潜力，从而促进功能性组织再生。水凝胶在RNAi治疗的局部递送和提供人工基质以帮助愈合过程中发挥着核心作用。例如，热响应水凝胶（例如，pluronicF-127、甲基纤维素和琼脂糖）通常用于传递miRNA或siRNA以加速伤口愈合。这种水凝胶的一个缺点可能是无法控制封装的RNAi治疗剂的释放速率。

为了解决这个问题，人们采用了物理和化学交联的水凝胶，并利用交联程度来控制RNAi治疗剂的释放速率。物理交联水凝胶的常见例子是两种带相反电荷的生物聚合物的逐层组装。增加层数导致RNAi疗法从这些水凝胶中缓慢释放。鉴于其物理性质，这些凝胶能够在2周内释放RNAi。对于化学交联水凝胶，其他变量也会影响RNAi治疗药物的释放速率。这通常取决于水凝胶内形成化学交联所涉及的实体。例如，交联可能是聚合物基质上的醛基和胺基之间的席夫碱键的结果。这些水凝胶通常会在一个月的时间内缓慢降解，因此它们会产生更长的RNAi治疗释放曲线。相反，由于聚合物基质和RNAi纳米载体之间的相互作用而形成的水凝胶降解得更快（最多7天），产生更短的释放曲线、。在这些情况下，纳米载体上的活性官能团的数量与相应的水凝胶交联密度之间存在直接相关性。因此，可以通过调节水凝胶中纳米载体的浓度来简单地调节封装的RNAi的释放速率。值得注意的是，具有活性表面功能的纳米载体可以并入化学交联的水凝胶网络中，作为对RNAi治疗剂的释放速率提供更多控制的一种方式。富含miRNA的水凝胶通过触发炎症阶段的消退来促进伤口愈合。结果表明，巨噬细胞浸润增加，并且巨噬细胞在体内有效局部极化至M2表型。水凝胶具有极高的吸水率，支持细胞附着和生长，从而促进伤口愈合。这些水凝胶示例为RNAi疗法提供了一系列不同的时间释放曲线，当考虑到伤口愈合是由精心安排的生物事件序列组成时，这是特别有益的。

值得注意的是，感染或局部创伤的风险通常与使用传统的伤口闭合方法（例如缝合）有关。因此，使用牢固附着在伤口上的水凝胶粘合剂可以作为物理屏障，保护伤口免受上述风险的影响，这些风险将强烈影响上皮再形成和愈合率。

其他应用

RNA分子在免疫调节方面受到了极大的关注，这主要是由于免疫细胞中关键因子的RNA沉默。粘性水凝胶已被用作免疫调节敷料。为了将树突状细胞(DC)化学吸引剂(MIP3a)和负载pDNA-siRNA的微粒联合递送至抗原呈递细胞，开发了一种原位可交联且快速降解的水凝胶。DC能够渗透水凝胶并有效吞噬携带pDNA-siRNA的微粒。与同等推注剂量相比，凝胶吸引的树突状细胞多四到六倍。最近的一项研究表明，在体内递送装载到壳聚糖-海藻酸盐水凝胶中的mRNA-lipoplex后，T细胞增殖和干扰素-γ分泌均增加。在第1周，观察到负载脂质复合物的水凝胶出现体液反应，而基于蛋白质的疫苗直到注射后2周才引发IgG产生，这增强了它们作为针对多种疾病的可行免疫方法的应用。

血管生成过程与伤口愈合和组织再生密切相关。因此，刺激血管的形成和成熟引起了极大的兴趣，特别是在治疗一些慢性皮肤伤口时。使用负载脂质体siRNA的琼脂糖水凝胶证明了开放性伤口床中普遍表达的基因（例如，mapk-1）的局部沉默。通过掺入聚氨酯（PUR）及其衍生物、聚酯聚氨酯（PEUR）或聚缩硫酮聚氨酯（PTK-UR）的水凝胶递送siRNANPs也被探索用于血管生成。调节释放速率引起体内沉默曲线的变化。沉默脯氨酰羟化酶结构域蛋白2（PHD2）会导致血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子的表达，同时水凝胶内的血管体积和厚度也增加。使用这些水凝胶进行局部PHD2siRNA递送在促进伤口愈合的血管生成方面显示出良好的前景。

表2总结了一些其他报道的应用，例如脊髓损伤、纤维化和炎症性疾病。

总结和未来方向

过去几十年来，大规模递送系统已经引起了该领域研究人员的关注，这种系统可以局部植入疾病组织，同时避免与全身递送RNA治疗相关的并发症。特别是，水凝胶可用于有效递送小分子和大分子，如化疗药物、蛋白质和遗传物质（如RNA），以及基于纳米颗粒的疗法。水凝胶作为一种三维基质框架，由于其生物相容性、生物降解性、载药能力和受控药物释放而在治疗领域受到关注。与全身给药相比，水凝胶系统具有许多优点，例如局部控制的RNA递送、低血液RNA浓度、高渗透性、很少的毒副作用、避免首过肝脏代谢以及最小的疼痛和不适70,75。将治疗和再教育疾病组织的局部平台与治疗现有远处疾病生态位的全身给药相结合，将提供高效的转化治疗平台，并改善临床结果。为了将其提升到一个新的水平，最近开发了具有纳米/微米水凝胶构建块的宏观水凝胶。然后，大尺度水凝胶的水解降解使得负载RNA的纳米/微米水凝胶逐渐释放，治疗后不会在疾病部位留下任何残留的生物材料。需要详细评估水凝胶-RNA设计复杂性、制造成本、监管政策和有效释放到靶组织之间的平衡，以便这些策略可以普遍应用于临床程序。

疾病位置和目标组织将决定水凝胶必要的物理属性，而疾病类型将决定合适的时空RNA释放曲线。具有自愈特性的注射水凝胶对于心脏输送非常有用，而具有粘合特性的局部水凝胶则更适合将RNA输送到皮肤。例如，自修复水凝胶可以承受注射过程中的剪切力以及心肌注射后由跳动肌肉产生的动力。当水凝胶也用作促进组织再生的支架基质时，必须考虑更多参数。这包括水凝胶的机械强度和降解率等参数，这些参数不可避免地会影响封装RNA治疗剂的释放率。例如，RNA递送到受损骨组织必须与愈合时间（大约3-4周）相匹配。因此，根据RNA的类型及其与特定愈合阶段的关联，递送时间可能从几天到几个月不等。此外，与疾病相关的组织微环境变化，例如pH值改变或某些酶的上调，可以在水凝胶设计中实现，以触发RNA释放。

如上所述，水凝胶介导的RNA递送的生物医学应用范围从组织再生到癌症治疗。然而，一个尚未探索的领域是利用水凝胶支架来支持RNA-细胞相互作用。在这里，当细胞迁移到水凝胶中与RNA相互作用时，水凝胶充当基因调控和工程的中转区域。该概念已被用于将先前基因修饰的人间充质基质细胞并入冷冻凝胶支架中。这些转基因细胞可以释放某些能够触发T细胞介导的抗肿瘤反应的抗体。最终，用于RNA-细胞相互作用的水凝胶支架可以通过同时编辑细胞中的某些基因并支持其增殖和存活，从而确保持续释放有效水平的抗体，从而产生组合效应。

水凝胶在该领域的另一个有前景的应用是RNA纳米疫苗的递送。2019冠状病毒病（COVID-19）大流行仍在世界各地肆虐，疫苗接种是最好的防御。经过不懈努力，两种基于脂质纳米粒子的mRNA疫苗（辉瑞/BioNTech的BNT162b2和Moderna的mRNA-1273）现已投入临床使用。最近，可注射水凝胶被用于在动物模型中局部递送严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)聚合纳米疫苗（含有SARS-CoV-2病毒刺突蛋白，有/无佐剂）。有趣的是，结果表明，与推注疫苗对照相比，在可注射水凝胶储库制剂中持续递送SARS-CoV-2刺突蛋白纳米疫苗的受体结合域(RBD)可实现更高的总抗RBDIgG滴度。通过将类似的概念纳入水凝胶中，可以将类似的概念应用于当前的SARS-CoV-2mRNA疫苗。目前，这些mRNA纳米疫苗需要间隔3-4周注射两剂。使用具有脉冲释放功能的水凝胶胶囊可以在3-4周内以脉冲方式释放疫苗，如果与游离纳米疫苗一起注射，可能会提供一次性疫苗接种。然而，还应该指出的是，在如此长时间的生理条件下，对水凝胶中mRNA的体内稳定性的研究还很少，这将是未来研究的一个重要领域。事实上，对于mRNA等较大的RNA，次优的稳定性只能引起短期的瞬时蛋白表达，并且需要NP等递送载体来保护它们免受酶促降解并提高其转染效率。使用水凝胶进行裸mRNA递送的报道很少。因此，对于未来修饰大RNA以提高稳定性和转染的努力来说，应用水凝胶进行裸RNA递送将更加富有成效。mRNA纳米疫苗的另一个问题是它们必须在低温下储存和运输。鉴于目前证据不足，确定适合在4°C甚至室温下长期储存mRNA的水凝胶非常重要。随着进一步的研究，水凝胶介导的mRNA疫苗递送可能成为传统核酸免疫方法的可行替代方案。

在这篇综述中，我们讨论了水凝胶作为RNA递送系统从设计到生物医学应用的使用。本文讨论的研究表明，水凝胶系统不仅能够持续局部递送RNA（避免重复给药），而且能够控制释放速率的空间和时间。迫切需要进一步研究负载RNA水凝胶的体内特性，如降解性、清除性、控释性和异物反应性。预计水凝胶设计和制造的不断改进将使这些令人兴奋的材料更接近RNA治疗的临床应用。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41563-023-01472-w